摘要
高温胁迫导致作物雄性不育，从而降低产量。为了探索组蛋白修饰在HT条件下对雄性生育能力的可能贡献，我们通过染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）在两个不同的陆地棉（Gossypium hirsutum）品种中定义了标记组蛋白H3赖氨酸27三甲基化（H3K27me3）和组蛋白H3-赖氨酸4三甲化（H3K4me3）的组蛋白甲基化景观。我们观察到，在高温处理的棉花花药中，H3K4me3和H3K27me3修饰，特别是H3K27mp3的整体破坏。高温处理对二价H3K4me3-H3K27me4修饰的影响大于对单价修饰的影响。我们确定，茉莉酸相关基因启动子处H3K27me3的去除增加了它们的表达，在花药开裂阶段的耐高温品种中，在高温下保持了雄性不育性。调节茉莉酸稳态或信号传导导致高温下花药不裂表型。化学抑制H3K27me3沉积增加了茉莉酸含量，并在高温下保持了雄性育性。总之，我们的研究为HT下组蛋白修饰对雄性生育能力的调节提供了新的见解，并提出了提高棉花耐高温性的潜在策略。
技术路线
The cotton (G. hirsutum) lines 84021 (HT tolerant) and H05 (HT sensitive) used in this study were grown in a greenhouse
vector construction and plant transformation
Phylogenetic analyses
Measurement of JA contents
Tissue sectioning, staining, and imaging
ChIP-seq、Histone modification data analysis
RNA-seq data analysis and GO term analysis
主要结果
3.1 高温下棉花花药H3K4me3和H3K27me3修饰的全基因组我们之前鉴定了两个棉花品系，84021（耐高温）和H05（高温敏感），它们对高温表现出不同的敏感性。在高温条件下，84021表现出正常的花药开裂并产生可育花粉，而H05花药保持不裂并产生不可见花粉（图1A）。我们使用针对组蛋白标记H3K4me3和H3K27me3的抗体进行染色质免疫沉淀，然后进行深度测序（ChIP-seq），在常温（NT）和高温条件下，在绒毡层降解阶段（TDS）和花药开裂阶段（ADS）收集来自品系84021和H05的花药。重复之间的高相关性表明其再现性。在染色体规模上，H3K4me3和H3K27me3修饰在棉花基因组的常染色体区域富集（图1B），与之前的研究一致。
我们使用MACS2软件来调用每个样本中每个组蛋白修饰的峰值，使用输入DNA作为阴性对照。与TDS和ADS下的NT相比，HT下84021和H05的H3K4me3峰值数量下降（图1C）。值得注意的是，H3K27me3峰的模式在H05和84021之间有所不同，在TDS和ADS下，在84021中，相对于NT，HT中的许多峰减少，但在H05中，相对于NT增加（图1C）。
由于棉花是异四倍体，我们研究了两个组蛋白标记在A亚基因组（At）和D亚基因组（Dt）中的分布。引人注目的是，无论基因型、条件或花药发育阶段如何，两个组蛋白标记沿Dt亚基因组比At亚基因组更丰富。然而，在HT下的所有样品中，来自At或Dt亚基因组的基因启动子区上H3K4me3和H3K27me3的变化通常相似，这表明H3K4me 3或H3K27mp3的变化可能同样影响At和Dt亚基因组。我们得出的结论是，H3K4me3和H3K27me3水平对HT暴露有反应，棉花品系84021和H05表现出相似的H3K4me3-图谱，但H3K27mp3的图谱不同。这种差异促使我们推测，在棉花花药对HT的反应中，H3K27me3标记可能比H3K4me3标记发挥更突出的作用。
为了研究在高温条件下84021和H05中H3K4me3和H3K27me3标记的变化，我们分析了在NT和高温条件下H3K4me3-和H3K27me3甲基转移酶和去甲基化酶的表达。我们发现，在高温下，H3K4me3甲基转移酶基因的表达在84021和H05之间没有显著变化，而在两个棉花系中，相对于NT，H3K4me3去甲基化酶基因在高温下的表达显著上调（图1D）。因此，我们的研究结果表明，在HT条件下观察到的H3K4me3和H3K27me3水平的变化可能至少部分是由H3K4me和H3K27me3甲基转移酶和去甲基化酶基因表达的变化引起的。
图1 HT胁迫下花药发育过程中的雄性育性表型和组蛋白甲基化模式。
（A） 84021和H05花药开裂期（ADS）的花药代表性图像（顶部）。
（B） Circos图总结了基因组26条染色体（At亚基因组为A01–A13，Dt亚基因组为D01–D13）的H3K4me3和H3K27me3图谱。
（C） 所有样品中H3K4me3峰和H3K27me3峰的数量。
（D） 基于RNA-seq数据，编码H3K4me3和H3K27me3写入物和擦除物的基因在NT和HT条件下84021和H05的TDS和ADS的表达水平。
3.2 高温下H3K4me3和H3K27me3的变化调节基因表达
在拟南芥中，H3K4me3在近端启动子区和转录起始位点（TSS）富集，而H3K27me3在整个基因体富集，在TSS附近的丰度略高。我们分别对H3K4me3和H3K27me3峰的位置进行了测序，并观察到H3K4me 3主要分布在启动子区（每个样品至少占所有峰的73%），定义为TSS上游1kb至下游1kb的区域，而H3K27me3主要分布在启动子（每个样品中至少43%）和基因间区域（每个样品至少35%）上，与之前在棉花中的报告一致。
接下来，我们进行了比较转录组分析，确定了与NT条件相比，在HT条件下84021和H05中TDS和ADS处的差异表达基因（DEG）。在两个阶段，相对于NT，我们在84021中检测到了更多的HT下调基因，在H05中检测到更多的TDS下调基因，而H05中的ADS上调基因更多（补充图5A）。GO富集分析显示，在H05的ADS中，DEG中的几种代谢途径富集，但在84021中没有。这些包括对激素的反应（GO:0009725）、转录调节、DNA模板化（GO:0006355）和脂质转运（GO:006869），表明H05中的这些独特途径可能解释了在HT下H05中观察到的雄性不育。
在每个样品中，我们在至少55%（或38.485）的所有启动子上检测到H3K4me3峰，在12%（或8499）的启动子上观察到H3K27me3峰。H3K4me3标记或H3K27me3标记发生变化的启动子数量的趋势与HT下观察到的全基因组H3K4me 3和H3K27mp3变化一致（图2A）。
在H05和84021中，在HT下失去H3K4me3修饰的启动子数量多于获得H3K4me3。在84021中，大多数在NT下携带H3K27me3标记的启动子在TDS和ADS下在HT下丢失，很少有启动子在HT下获得H3K27mp3标记，与NT条件相比，在HT条件下获得H3K27me3标记的启动子数量是在ADS上失去的启动子的三倍（图2A）。
研究启动子区H3K4me3或H3K27me3的丰度（图2B）显示，在TDS条件下，两个棉系中H3K4me 3的相对丰度均未发生实质性变化，而在84021高温条件下，在TSS下游的ADS条件下，H3K4me的相对丰度有所下降，但在H05条件下没有下降（图2B）。在84021 TSS下游的TDS和ADS处，H3K27me3的相对丰度也有所下降（图2B），而在HT条件下，H05的TDS处H3K27me3的相对丰度有所下降，ADS处H3K27me3相对丰度有所增加（图2B）。
图2 在HT条件下H3K4me3和H3K27me3的变化和表达调控。
（A） 与相应的NT样品相比，在HT条件下在不同样品中获得（右）或失去（左）H3K4me3或H3K27me3标记的启动子的数量。
（B） 显示在NT和HT条件下84021和H05启动子区的标准化H3K4me3和H3K27me3标签密度图。
（C） 84021中NT条件下ADS阶段蛋白质编码基因的基因体上的标准化H3K4me3信号（右）和H3K27me3信号（中）
（D） 基因表达水平作为H05中NT下ADS阶段H3K4me3修饰状态或H3K27me3修饰状态的函数。
（E和G）Venn图显示了在84021 HT和NT条件下的ADS阶段，差异表达基因（DEGs）和其启动子表现出H3K4me3水平变化的基因（E）或DEGs以及其启动子呈现出H3K27me3水平变化（G）的基因之间的重叠程度。
（F） 在所有样品中，其启动子中H3K4me3水平在相同方向或相反方向上发生变化的DEG的分数。
（H） 在ADS样品中，其启动子中H3K27me3水平在相同方向或相反方向上发生变化的DEG的部分。
为了研究哪些途径在HT下被H3K4me3和H3K27me3标记单独调节，我们统计了每个样品中在HT下H3K4me3-或H3K27mp3水平发生显著变化的启动子的数量。只有少数启动子（平均占所有修饰启动子的15%或11%）分别显示出H3K4me3或H3K27me3水平的显著变化。
为了进一步研究H3K4me3或H3K27me3具有差异修饰启动子（DMPs）的基因的功能，我们对每组DMPs进行了GO分析。在TDS或ADS处，我们没有检测到与H05或84021中富含H3K4me3的DMPs相关的基因与育性控制明显相关的途径。只有与H05中ADS处上调的H3K4me3-DMPs有关的基因在与次级代谢产物相关的途径中富集，如α-氨基酸代谢过程（GO:1901605）和氯合物生物合成过程（GO:0009423）（图3A）。
值得注意的是，与H05中ADS上调的H3K27me3 DMPs相关的基因在JA介导的信号通路（GO:0009867）、花药发育（GO:009867）和对蔗糖的反应（GO:0007974）中显示富集（图3B；补充表7）。因此，根据从HT敏感棉花品系H05中与H3K27me3相关的DMPs相关的基因获得的GO结果，我们推测H3K4me3在HT诱导的雄性不育中的作用弱于H3K27me3。
图3 在HT条件下，H3K4me3–H3K27me3标记的变化更为明显。
（A和B）富含启动子在HT下表现出H3K4me3（A）或H3K27me3（B）水平显著变化的基因的生物过程。颜色键表示上调（右）和下调（左）DEG中富集GO项的显著性（log10（P值））。
3.3 H3K4me3–H3K27me3标记在HT下表现出更显著的变化
尽管在HT条件下，在ADS处，H3K27me3的图谱在84021和H05之间存在差异（图1C和2B），但H3K4me3和H3K27mp3修饰通常共存于同一核小体上，以调节基因表达和染色质状态；已知携带这两个标记的核小体具有二价组蛋白标记。
为了探索H3K27me3在二价组蛋白标记中是单独作用还是与H3K4me3成对作用，以影响对HT的花药发育，我们通过将基因组分为四组来研究它们在棉花花药中的相对代表性：仅H3K4me3-区域、仅H3K27me4区域、H3K4me3-H3K27mp3二价区域和无标记区域（补充图8A）。仅H3K27me3和二价区主要出现在启动子处（补充图8B），大多数H3K27me3标记定位于二价区。例如，71.7%（12 759个中的9147个）携带H3K27me3标记的启动子和19.7%（46 132个中的9147%）携带H3K4me3标记的启动剂在NT下H05的ADS处处于二价状态（图3C）。仅H3K27me3和二价标记抑制了棉花花药中的基因表达（图3D），类似于哺乳动物的结果。启动子单独被H3K27me3标记的基因似乎比启动子上有二价标记的基因受到更强烈的抑制，这表明H3K27mp3的作用更强（图3D；补充图10）。有趣的是，二价启动子上的标准化H3K4me3丰度显著低于单价H3K4me3-标记的启动子（图3E），而二价启动机中的H3K27me3丰度显著高于单价H3K27mp3标记的启动机（图3F）。
为了进一步研究在HT条件下二价标记的变化，我们分析了具有单价或二价标志的启动子。以H05的ADS为例，其中H3K4me3水平在HT下降低而H3K27me3水平增加（图1C和2A），在HT下，二价启动子上的H3K4me3-水平比单价H3K4me-3标记的启动子中的H3K4me 3水平下降得更显著，而在HT下，二价启动子上的H3K27me3水平比单价H3K4me3标记的启动子更显著地增加（图3G和3H）。我们对大多数其他样本获得了类似的结果。这些结果表明，在HT下，具有二价标记的区域比具有单价标记的区域变化更大。
我们更仔细地观察了所有样本中带有二价标记的启动子。在H05中，失去二价状态的启动子大多在ADS处失去H3K4me3标记，但在TDS处大多失去H3K27me3标记；在84021中，启动子在两个阶段大多失去H3K27me3标记。相反，获得二价状态的启动子主要在H05的TDS和84021的ADS处获得H3K4me3标记，而在TDS的84021和在ADS的H05处获得H3K27me3标记（图3I）。我们观察到，与84021中的基因相比，这些基因中的大多数在HT下的H05中被抑制，这与早期的观察结果一致，即二价和H3K27me3标记与基因表达的抑制有关。
我们对启动子（DMP）中具有二价差异修饰的基因进行了GO分析。令人惊讶的是，H05中ADS处的二价DMP与H3K27me3标记的DMP共享一些相同的富集途径，包括JA介导的信号通路（GO:0009867）、对蔗糖的反应（GO:0007974）和花药发育（GO:009867）（图3J；补充表8）。这些结果表明，H3K27me3状态的变化是H05中HT条件下ADS花药发育的主要驱动因素（补充图13B–13D），进一步说明了H3K27mp3标记在HT反应中的重要性。
图3 在HT条件下，二价H3K4me3–H3K27me3标记的变化更为明显。
（C） Venn图显示了在NT条件下H05的ADS阶段，H3K4me3修饰的启动子和H3K27me3修饰的启动基因之间的重叠程度。其他样品如补充图9所示。
（D） 其启动子仅携带H3K4me3、仅携带H3K27me3或同时携带这两种标记的基因在NT下的H05的ADS阶段的标准化表达水平。（E和F）在NT条件下H05的ADS阶段，具有二价H3K4me3–H3K27me3标记或仅H3K4me三的启动子
（E）和具有二价H3K4me3-H3K27me4标记或仅有H3K27mp3的启动子的标准化标签号的Metaplot（F）。
（G） 在H05的ADS处具有二价H3K4me3–H3K27me3标记或单个H3K4me3.启动子中，HT和NT之间的H3K4me3-信号强度的比率。
（H） 在H05的ADS处具有二价H3K4me3–H3K27me3标记或单个H3K27mp3的启动子中，HT和NT之间的H3K27me3信号强度的比率。
（I） 在NT条件下具有二价标记的启动子的数量及其在HT条件下所有样品中的显著变化。顶部，在HT下失去二价标记的启动子；底部，在HT下获得二价标记的启动子。
（J） 富含启动子在二价标记上表现出显著变化的基因的生物过程。
3.4 去除H3K27me3可增加高温下JA含量并保持雄蕊生育能力
JA途径已被证明对棉花花药中的HT胁迫有反应，但JA如何对HT做出反应尚不清楚。在HT下H05的ADS中，GO分析显示，在启动子显示H3K27me3水平显著较低的基因中，与JA相关途径相关的基因富集（图3B和3J）。因此，我们推测JA可能通过H3K27me3参与对HT的反应。
为了验证这一假设，我们检索了在ADS阶段具有H3K27me3修饰的所有JA生物合成和信号传导基因，并评估了它们在NT和HT条件下的H3K27mp3水平。我们确定，在高温下，与JA生物合成和信号转导相关的基因中的H3K27me3水平通常在84021中降低，但在ADS阶段的H05中增加（图4A和4C）。特别是，在高温条件下，84021中JA生物合成基因的H3K27me3水平急剧下降（图4A）。
然后，我们通过去除所有样本中<1FPKM表达的任何基因来关注表达的基因。对于其余表达的基因，表达和H3K27me3水平显示出相反的模式：在84021中，在HT下H3K27mp3水平较低的基因比在NT下表达更高，而在H05中在HT下具有较强H3K27me3信号的基因的表达水平低于在NT下（图4B和4D；补充表9）。这一结果与H3K27me3作为抑制标记的作用一致。
基于这些结果，我们假设高温下棉花花药中H3K27me3水平的变化导致JA相关基因的表达变化，最终影响高温下的JA含量，促使我们在NT和HT条件下测量JA水平。我们观察到H05或84021在TDS阶段的JA含量没有显著差异，但在H05和84021中，在HT下的ADS处检测到JA含量显著较低（图4E），表明在HT下ADS处H05花药中JA含量的破坏。
为了测试较低的JA水平是否是HT引起花粉不育的原因，我们在将H05花暴露于HT之前将外源性MeJA施用于H05花。重要的是，外源性MeJA在HT下恢复了H05的雄性育性（图4F）。总之，我们的结果表明，在高温下，在H05中JA相关基因启动子区的H3K27me3水平增加，但在84021中降低，导致在高温下84021（耐高温）中JA相关性基因表达激活，但在H05（耐高温敏感）中相对抑制。H05中JA稳态的破坏可能最终导致HT下的雄性不育。
图4。H3K27me3通过在HT条件下调节许多JA相关基因来调节JA稳态。
（A–D）在NT和HT条件下，84021和H05中ADS中所有JA生物合成基因（A和B）和所有JA信号转导基因（C和D）启动子的表达水平（B和D）和H3K27me3（A和C）修饰水平的热图表示。
（E） 在NT和HT条件下，H05和84021在TDS和ADS下的JA含量。
（F） 每个处理的代表性花药表型。
3.5 GhAOS和GhAOC2的突变和GhJAZ1的过表达通过抑制JA信号传导导致雄性不育
AOS催化氢过氧化物脱水为不稳定的氧化烯，其被氧化烯环化酶2（AOC）环化，在JA生物合成途径中形成顺式-（+）-氧代植物二烯酸。与NT相比，84021中GhAOS（Ghir_D06G001100）和GhAOC2（Ghir_A08G004050）基因座的H3K27me3水平较低，但在HT条件下H05中没有显著变化（图5A）。此外，与NT相比，84021中的GhAOS和GhAOC2表达更高，但在HT下的H05中没有显著变化（图5A）。GhAOS和GhAOC2的相对低表达与我们的假设一致，即这会导致HT下的雄性不育。
为了验证这一预测，我们通过CRISPR-Cas9介导的HT敏感系Jin668基因编辑获得了GhAOS（Ghir_D06G001100）和GhAOC2（Ghir_A08G004050）的突变体（图5B）。与野生型（WT）相比，Ghaos和Ghaoc2突变体已经显示出雄性不育表型，在NT下具有花药不裂（图5C）。JAZ蛋白通过与一系列转录因子的相互作用抑制JA信号传导。
类似地，与NT相比，在HT条件下H05和84021之间，GhJAZ1（Ghir_A08G025920）在GhJAZ11基因座上的表达和H3K27me3水平存在差异。当我们过表达GhJAZ1时，得到的过表达系（JAZ1-OE#1，JAZ1-OE#2）显示出部分不裂的花药（图5D和5E）。这些结果表明，改变JA相关基因的功能确实会导致雄性不育，在高温下通过影响H3K27me3水平来干扰JA相关的基因的表达水平也是如此。
图5。JA相关基因功能异常导致雄性不育。
（A） GhAOS和GhAOC2基因座的综合基因组学查看器窗口显示84021和H05中的H3K27me3信号及其在ADS中的表达水平。
（B） GhAOS的基因组编辑，产生GhAOS植物1和植物2。sgRNA靶位点和原间隔区相邻基序（PAM）区域分别以绿色和下划线突出显示。
（C） WT、一个Ghaos突变体和一个Ghooc2突变体的花的代表性图像。Ghaos和Ghaoc2的花药不开裂。
（D） 来自WT（YZ1）和GhJAZ1过表达系（JAZ1-OE#1和JAZ1-OE#2）的花在NT条件下的代表性图像。红色箭头表示花药不开裂。
（E） WT和GhJAZ1过表达系花药开裂的频率。
3.6 抑制H3K27me3沉积可恢复HT条件下的雄蕊的生育能力
由于H3K27me3水平在耐高温系84021中降低，但在耐高温敏感系H05中增加（图1C），我们将组蛋白甲基转移酶抑制剂GSK343喷洒到H05花蕾（四分体期[TS]和TDS）上以降低H3K27mp3水平（图6A）。七天后，我们使用抗H3K27me3抗体和花药在HT下H05的ADS处进行ChIP-seq。与仅用水喷洒的对照相比，我们检测到喷洒H3K27me3抑制剂的花药中H3K27me3水平显著降低（图6A和6B）。与模拟处理的花药相比，喷50μM GSK343的H05花药在高温下具有更高的花药开裂率和花粉活力（图6D）。花药横截面分析证实，在用GSK343处理后，H05在高温下的花药不裂和褶皱花粉外观得到了挽救（图6E）。我们从H05的ADS处收集了经过模拟处理或GSK343处理并进行HT以用于RNA测序（RNA-seq）的花药。
我们在这两组样品之间鉴定了1015个DEG，在GSK343处理的样品中有400个上调基因和615个下调基因（图6C）。这些DEG在两个主要的GO术语中富集：激素分解代谢过程（GO:00042447）和JA代谢过程（GO：0009694）（图6F）。我们进一步研究了H3K27me3水平以及JA生物合成和JA反应基因的表达水平。与模拟处理的花药相比，GSK343处理的花药在JA生物合成和JA反应基因中的H3K27me3水平显著降低；此外，JA生物合成基因的表达显著高于对照样品，而JA反应基因的表达明显较低（图6G）。有趣的是，在处理的花药中，GhAOS和GhAOC2的H3K27me3水平降低，而这些基因的表达显著增加（图6H-6J）。此外，喷洒GSK343的花药中JA含量显著高于模拟处理的花药（图6K）。这些结果表明，较低的H3K27me3沉积增加了高温条件下H05系棉花花药的JA含量，恢复了雄性育性。
图6 在高温条件下抑制H3K27me3的沉积恢复了棉花的雄性生育能力。
（A和B）在H05–H3K27me3抑制剂-HT处理和H05–水-HT处理中，ADS启动子区的H3K27me3修饰水平的标准化H3K27mp3修饰水平（A）和（B）。
（C） ADS处H05–H3K27me3抑制剂-HT处理和H05–水-HT处理之间的DEG火山图。
（D） 外源H3K27me3抑制剂对H05花药的处理挽救了其不育缺陷。红色花粉粒是可育的，而白色花粉粒是不育的。
（E） H05-水-NT、H05-水-HT、H05-H3K27me3抑制剂-NT和H05-H3K27me3抑制剂-HT在TDS和ADS的花药切片显示，用H3K27mp3抑制剂处理可以挽救花粉发育。
（F） 在ADS的H05–H3K27me3抑制剂-HT处理和H05–水-HT处理之间，DEG中的GO项显著富集。
（G） 在ADS的H05–H3K27me3抑制剂-HT处理下，与JA生物合成和JA反应相关的基因的H3K27me3修饰和mRNA表达水平的变化。
（H和I）GhAOS（H）和GhAOC2（I）基因座的综合基因组学查看器窗口，显示它们在H05–H3K27me3抑制剂-HT处理和H05–水-HT处理中的H3K27me3信号和ADS的mRNA水平。（J） 通过RT–qPCR测定，在ADS的H05–H3K27me3抑制剂-HT处理和H05–水-HT处理中，GhAOS和GhAOC2的相对表达水平。
（K） H05–H3K27me3抑制剂-HT处理和H05–水-HT处理中的JA含量。样品是在温室里采集的。
结论
在本研究中，我们描述了高温下棉花花药中H3K4me3和H3K27me3的第一个全局图谱。棉花花药中的许多H3K27me3标记与H3K4me3以二价态存在。从JA生物合成基因中去除H3K27me3有助于JA稳态，从而使耐热品系在高温下具有正常的育性。
相反，JA生物合成基因组中高水平的H3K27me3标记导致HT敏感品系中相当低的表达水平，导致JA含量显著降低，并最终导致HT下的雄性不育。因此，我们的研究为HT胁迫下表观遗传修饰对雄性生育能力的调节提供了新的见解，并为通过改变靶启动子的表观遗传状态创造耐高温品种提供了候选者（图7）。
图7。H3K27me3通过调节茉莉酸稳态介导的棉花雄性耐热性控制模型。
H3K27me3修饰水平在耐高温品系中JA生物合成基因启动子处降低，但在耐高温条件下在耐高温敏感品系中保持在高水平，从而在高温条件下激活（耐高温）或抑制（耐高温敏感）JA生物合成基因的表达。耐高温品系中JA生物合成基因表达的增加导致正常的JA稳态，最终导致耐高温条件下的雄性不育。在HT敏感系中，JA生物合成基因的相对低表达导致JA稳态紊乱，最终导致HT条件下的雄性不育。
原文获取
原文链接：
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2590346223001888?ref=pdf_download&fr=RR-2&rr=804d7ee1dbcf9456
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https://www.scientsgene.com/h-col-107.html